作者：ZZT

导读：

近日，中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所付海根课题组与杨兆勇课题组合作，利用工程化亚胺还原酶（IREDs），经串联分子间/分子内还原胺化，首次实现了四邻位取代二苯[c,e]氮杂䓬的催化不对称合成。该方法以外消旋联芳基二醛（rac–4a）和苄胺为原料，由同一种IRED催化两步还原胺化，并借助动态动力学拆分（DKR）构建轴手性；产物收率最高达97%，对映体比例（er）最高可达99:1以上，为这类大位阻桥联联芳基分子提供了新的合成途径相关成果发表于Angew. Chem. Int. Ed.。协和药生所研究生周梓添、晏宇轩以及梵帅助理研究员为共同第一作者，协和药生所黄玲助理研究员、杨兆勇研究员、付海根研究员为共同通讯作者。

Atroposelective Construction of Tetra-ortho-substituted Dibenz[c,e]azepines Using an Engineered Imine Reductase.

Zitian Zhou^#, Yuxuan Yan^#, Shuai Fan^#, Zhouchang Yao, Wenbang Wang, Keting Li, Tianzhang Qiao, Ling Huang*, Zhaoyong Yang*, Haigen Fu*.

Angew. Chem. Int. Ed., 2026, e1024447. DOI: 10.1002/anie.1024447.

正文：

轴手性二苯[c,e]氮杂䓬是一类具有桥联联芳基结构的含氮杂环骨架，在不对称合成与催化中具有重要应用价值，该类骨架也存在于生物活性分子中（图1A）。然而，在构建七元含氮环的同时实现联芳基轴手性控制，仍面临环张力与立体控制的双重挑战。现有不对称合成方法主要依赖“中心手性向轴手性传递”策略，且多适用于空间位阻较小的邻位二取代体系，仅少数可拓展至邻位三取代体系。对于四邻位取代的二苯[c,e]氮杂䓬骨架，因手性轴周围空间位阻极大，原有手性传递策略难以奏效，迄今尚缺乏相关催化不对称合成方法的报道（图1B）。

近日，中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所付海根课题组与杨兆勇课题组合作，利用工程化亚胺还原酶（IREDs），经串联分子间/分子内还原胺化，首次实现了四邻位取代二苯[c,e]氮杂䓬的催化不对称合成。该方法以外消旋联芳基二醛（rac–4a）和苄胺为原料，由同一种IRED催化两步还原胺化，并借助动态动力学拆分（DKR）构建轴手性；产物收率最高达97%，对映体比例（er）最高可达99:1以上，为这类大位阻桥联联芳基分子提供了新的合成途径（图1C）。

图1. 轴手性二苯[c,e]氮杂䓬的应用与合成策略。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

首先，作者以联芳基二醛rac–4a与苄胺5a作为模型底物，对一系列亚胺还原酶进行筛选。来源于Streptomyces tricolor的IRED-04可催化该反应，以50%的收率和99:1的er得到目标产物 (R)-6（图2A）。经反应条件优化后，在0.2 mol%酶用量下，野生型IRED-04催化的收率提高至57%，但催化效率仍需进一步提升。为此，研究团队解析了IRED-04与辅酶NADPH复合物的晶体结构，并结合分子对接进行了三轮结构引导的定向进化，最终获得三突变体IRED-04-M3（A129F/N239G/I217Q）（图2B）。在25 ℃下，该突变体使模型反应的收率提高至82%；将温度升至37 ℃后，分析收率进一步提高至94%，同时保持99:1的er。此外，采用IRED-04-M3粗酶冻干粉也可获得96%的收率和99:1的er（图2C）。

图2. 模型反应筛选与酶工程改造。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

其次，作者考察了工程化酶IRED-04-M3催化反应的底物适用范围。对于胺供体，多种带有吸电子或给电子取代基的苄胺，以及含吡啶、噻吩和呋喃等杂环的胺类底物均可参与反应，烯丙胺和环丙基甲胺也可转化为相应产物。对于联芳基二醛，该体系同样可接受不同取代的联苯骨架及含萘环的底物，产物分析收率最高达到97%，er最高超过99:1，部分底物的反应活性或选择性仍有提升空间（图3）。随后，作者选取代表性底物开展0.1 mmol规模的制备实验，以58–85%的分离收率获得目标产物。在5 mmol规模的模型反应中，分离得到1.05 g目标产物 (R)-6，分离收率为66%，er为99:1，验证了该酶促级联反应在克级制备中的可行性。

图3. 底物范围拓展。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

最后，作者结合中间体捕获、还原对照实验、密度泛函理论计算及分子动力学模拟，对级联反应过程与立体控制机制进行了研究。利用能够积累环状亚胺鎓中间体的酶突变体（A129F/L221F），并引入邻羟基苄胺作为亚胺鎓捕获试剂，作者获得了含N,O-缩醛结构的产物32，这表明底物4a中下半部分的2位醛基首先参与分子间还原胺化（图4A）。随后，作者通过提前终止酶反应获得了含亚胺鎓中间体3a和产物 (R)-6的混合物，并分别对其进行化学还原与酶促还原：使用非选择性还原剂NaBH₄时，3a完全转化，但产物er仅为57:43；重新采用IRED-04-M3催化时，3a可完全转化，所得产物er为99:1。这表明中间体3a为消旋物，并支持该步酶促还原通过DKR构建轴手性。据此，作者提出该酶催化串联反应可能的机理：首先，rac–4a与5a发生分子间还原胺化生成33，随后进一步形成环状亚胺鎓中间体rac–3a。其中，33或rac–3a通过可逆形成六元半缩醛34实现轴手性的快速消旋化，而IRED-04-M3优先识别并还原 (R)-3a，最终通过DKR生成构型稳定的产物 (R)-6（图4C）。分子动力学模拟提示，N239G突变可扩大结合口袋，并可能使中间体的苄基采取不同的结合取向。与野生型相比，M3突变体中的 (R)-3a呈现更短的辅酶烟酰胺环C4与亚胺鎓碳之间的距离，以及更有利的计算结合能，这为其催化效率提升提供了可能的解释（图4D、E）。

图4. 机理研究与分子动力学模拟。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

总结

本研究通过结构指导的定向进化，获得了能够连续催化分子间和分子内还原胺化的工程化亚胺还原酶，并借助动态动力学拆分策略，首次实现了四邻位取代的轴手性二苯[c,e]氮杂䓬的不对称合成。该策略在构建七元含氮环的同时实现了轴手性控制，展示了生物催化在大位阻桥联联芳基合成中的应用潜力，也为相关轴手性含氮杂环的制备提供了新的酶催化方法。